Wstęp

Pętle typu GNRA

• Pętla typu GNRA (gdzie N to dowolny nukleotyd, czyli A, C, G lub U, a R to puryna czyli A lub G) to najczęstszy motyw strukturalny RNA
• Cechą charakterystyczną wszystkich 8 możliwych układów jest niekanoniczne wiązanie G-A stabilizujące układ
• Dwa pozostałe nukleotydy N i R tworzą wiązania wodorowe z odległymi fragmentami jednoniciowymi lub białkami
• Utrzymują się w ten sposób przestrzenne interakcje wpływające na całościowe zwinięcie się struktury
• Biorą one udział w stabilizacji, szczególnie dla dużych struktur RNA (1000+ nukleotydów)
• Wizualizacja poniżej przedstawia strukturę drugorzędową dla 1ZIH (tutaj pętla to GCAA):
  

Symulacje dynamiki molekularnej

• Symulacja dynamiki molekularnej to iteracyjne powtarzanie rozwiązywania równań ruchu Newtona dla układu atomów (powiązanych odpowiednimi ograniczeniami wynikającymi ze struktury i właściwości własnych atomów)
• Punktem początkowym jest struktura (współrzędne wszystkich jej atomów), najczęściej umieszczona w wodzie z jonami celem zobojętnienia
• Układ posiada też temperaturę (czyli de facto wektory prędkości dla każdego z atomów) i znajduje się pod określonym ciśnieniem
• Każdy krok symulacji odpowiada niewielkiej zmianie czasowej (często 1 fs, czyli 1e-15 s)
• Symuluje się różnej długości trajektorie w zależności od problemu badawczego
• Dynamika molekularna pozwala też na:
  • sprawdzenie stabilności struktury po wprowadzeniu modyfikacji lub mutacji,
  • analizę interakcji czwartorzędowych (np. przeprowadzenie tzw. dokowania ligandu do miejsca aktywnego białka),
  • pełnoatomowe potwierdzenie eksperymentalnych wyników (np. temperatura topnienia RNA/DNA to temperatura, w której 50% składu próbki ulega denaturacji; przy pomocy symulacji można ten proces prześledzić dokładniej),
  • przewidzenie struktury trzeciorzędowej na podstawie jej sekwencji,
  • i wiele innych…
• Poniższy film przedstawia symulację pętli GNRA, w której autorom udało się z formy w pełni rozwiniętej (unfolded) otrzymać końcową postać znaną z wielu innych badań strukturalnych: (źródło: High-Resolution Reversible Folding of Hyperstable RNA Tetraloops Using Molecular Dynamics Simulations)

Przeprowadzenie własnej symulacj

Wymagane oprogramowanie

• VMD
• NAMD

Pliki potrzebne do przeprowadzenia symulacji

• Początkowa struktura (współrzędne atomów) w formacie PDB (w naszym przypadku: 1ZIH

  • W okienku VMD Main wybieramy menu File → New Molecule
  • Poprzez Browse wybieramy plik 1ZIH.pdb i klikamy Load

  

• Informacja o strukturze w formacie PSF:

  • W okienku VMD Main wybieramy menu Extension → Modeling → Automatic PSF Builder
  • W okienku AutoPSF w menu Options zaznaczamy Add solvation box i Add neutralizing ions
  • W sekcji Step 1: … klikamy Load input files
  • W sekcji Step 2: … zaznaczamy Nucleic Acid i klikamy Guess and split …
  • W sekcji Step 3: … klikamy Create chains

  

Symulacja przy pomocy AutoIMD (NAMD)

• W okienku VMD Main wybieramy menu Extensions → Simulations → AutoIMD (NAMD)

• W okienku AutoIMD Controls wybieramy menu Settings -> Simulation Parameters

  • Zmieniamy DCD save frequency na 1000 (jest to częstotliwość zapisu “klatek” w trajektorii)
  • Zmieniamy IMD communication rate na 100 (jest to częstotliwość aktualizowania VMD)

  

• W okienku AutoIMD Controls wybieramy menu File → Show Simulation Window

• W okienku AutoIMD Controls w polu imdmolten (ruchome atomy) wpisujemy nucleic i klikamy Submit

• Kliknięcie Connect uruchomi symulację, ale zanim to się stanie polecam zmienić sposób wizualizacji struktury RNA:
  • W okienki VMD Main mamy listę struktur i plików PSF, dwukrotnie klikamy na litery D we wszystich wierszach oprócz AutoIMD Simulation. Dwukrotne kliknięcie zmieni literę D na czerwoną i sprawi, że dane atomy nie będą widoczne, zatem przestaniemy widzieć atomy tworzące wodę i jony
  • W okienku VMD Main wybieramy menu Graphics → Representations
  • Ustawiamy Selected Molecule na AutoIMD Simulation
  • Klikamy Create Rep
  • W polu Selected Atoms wpisujemy nucleic
  • Jako Drawing Method wybieramy HBonds
  • Jako Coloring Method wybieramy ColorID z wartością 4
  • Możemy też zwiększyć Line Thickness do wartości 4
  • W głównym oknie VMD widzimy teraz tylko RNA oraz na żółto zaznaczone wiązania wodorowe między zasadami
• Gdy w okienku AutoIMD Controls klikniemy Connect to uruchomi się symulacja, domyślnie etap equilibration. Można oglądać efekty w głównym oknie VMD oraz w logach w okienku IMD Connection
• Etap ten kontynuuje się dopóki zachodzą jakieś znaczące zmiany, ale w momencie gdy system zaczyna oscylować wokół tych samych stanów można zatrzymać symulację klikając Pause (na potrzeby eksperymentu, zatrzymajmy symulację po 10 tys. kroków = 20 ps czasu)

• Tryb symulacji zmieniamy w okienku AutoIMD Controls w menu Settings → Minimization Mode i uruchamiamy ciąg dalszy klikając Pause. Minimalizację przeprowadza się dopóki symulacja nie zatrzyma się w optimum lokalnym (na potrzeby eksperymentu, zatrzymajmy symulację po 40 tys. krokach)

Analiza przebiegu symulacji

• Do wykonania kroków poniżej sugeruję zacząć z czystą sesją VMD:

  • W okienku VMD Main zaznaczamy wszystkie wiersze i wybieramy z menu Molecule → Delete Molecule
  • Ewentualnie można wyłączyć i włączyć ponownie VMD :)

• Namd generuje zestaw plików wyjściowych, a plugin AutoIMD domyślnie umieszcza je w $HOME/autoimd. Nas interesować będzie autoimd.log (tekstowy log z przebiegu symulacji) oraz autoimd.dcd (binarnie zapisana trajektoria = pozycje atomów zapisywane co pewną liczbę iteracji)

• Aby otworzyć trajektorię w VMD:

  • Wybieramy z menu File → New Molecule
  • Upewnijmy się, że pole Load files for: ma wartość New Molecule
  • Wybieramy plik autoimd.psf (Uwaga! Lepiej wybrać plik PSF niż PDB. Dla tego drugiego wczytanie trajektorii też zadziała, ale wówczas VMD nie skorzysta z pełni informacji o strukturze jaka jest tylko w PSF)
  • Po naciśnięciu Load okienko wczytywania powinno zostać aktywne, a pole Load files for: zmieni wartość na autoimd.psf
  • Wybieramy plik autoimd.dcd i klikamy Load

• Aby przeanalizować plik logu w VMD:

  • Wybieramy z menu Extensions → Analysis → NAMD Plot
  • W nowym okienku wybieramy File → Select NAMD Log File i wskazujemy na plik autoimd.log
  • Zaznaczmy przykładowo BOND, ANGLE oraz DIHED odpowiadające trzem komponentom funkcji energii w modelu

  

  • Wybieramy z menu File → Plot Selected Data

  

Analiza gotowej, dłuższej trajektorii

• Pełniejszą i trójetapową symulację (minimalizacja, podgrzewanie, swobodny ruch) możemy przeanalizować dzięki uprzejmości dr Joanny Sarzyńskiej

  • Pobierzmy i rozpakujmy archiwum
  • Wybieramy w VMD File → New Molecule
  • Upewnijmy się, że Load files for: ma wartość New Molecule
  • Wskazujemy na plik 1ZIH_js.psf (ponownie, nleży użyć pliku PSF, a nie PDB) i klikamy Load
  • We wciąż otwartym oknie Molecule File Browser, z polem Load files for: ustawionym na 1ZIH_js.psf wskazujemy na plik min.dcd z pobranego archiwum i klikamy Load
  • Powtaramy poprzedni krok dla heat.dcd i następnie run1.dcd (w taki właśnie sposób “doczytuje” się kolejne ramki z zapisanej trajektorii, VMD dokłada je na końcu tworząc spójny, jednolity obraz symulacji)

• Uruchom całą symulację (przycisk ▶ w oknie VMD Main), możesz sterować suwakiem speed by spowolnić wizualizację kolejnych kroków

• Sprawdźmy przebieg zmian strukturalnych w czasie trwania symulacji:

  • Wybieramy z menu głównego okna VMD Extension → Analysis → RMSD Trajectory Tool
  • W polu edycyjnym w lewym górnym rogu (jest to zaznaczenie fragmentu, którego ma dotyczyć analiza) wpisujemy nucleic
  • Klikamy najpierw przycisk ALIGN, następnie RMSD
  • Wybieramy w menu File → Plot Data aby zobaczyć wykres zmieniającego się RMSD w zależności od numeru ramki (Uwaga! Różne etapy symulacji miały różny odstęp czasowy pomiędzy zapisem współrzędnych do pliku trajektorii. Oznacza to, że między sąsiednimi ramkami nie zawsze jest ta sama różnica w czasie)

  

• Sprawdźmy zmiany liczby wiązań wodorowych w czasie trwania symulacji:

  • Wybieramy z menu głównego okna VMD Extensions → Analysis → Hydrogen Bonds
  • Jako Selection 1 podajemy nucleic
  • Klikamy Find hydrogen bonds